Исследовать и разработать методы функционализации и биоконъюгирования наноструктур для создания биосенсоров. Разработка новых флуоресцентных биосенсоров для оптической диагностики патологических состояний организма посредством детектирования нуклеиновых к

grgu_admin - Fri, 01/10/2020 - 23:38
Программа:
Вид научной деятельности:
Вид создаваемой научно-технической продукции:
Дата начала работ:
Дата окончания работ :
Цели:

Цель проекта: создание чувствительных флуоресцентных сенсоров для количественного определения нуклеиновых кислот, амилоидных фибрилл и измерения микровязкости жидкостей.

Решаемые задачи:

Для достижения указанной цели решены или решаются следующие основные задачи:

  1. Синтезировать широкий ряд новых флуоресцентных зондов (флуоресцентных молекулярных роторов, ФМР), чувствительных к вязкости микроокружения, на основе производных тиофлавина Т, цианиновых красителей (тиазолового оранжевого и т.п.). Исследовать их фотофизические и флуоресцентные свойства для свободных молекул ФМР и их комплексов с амилоидными фибриллами, нуклеиновыми кислотами.
  2. Синтезировать новые производные ФМР-линкер, позволяющие производить эффективную иммобилизацию данных молекул на поверхностях стекла, полимерных микросфер, металлов. Для этого в состав молекул будет вводиться заместитель – алкильная цепь, содержащая функциональные группы (-SH, -COOH, -NH2).
  3. Изучить структуру фотофизические свойства синтезированных соединений ФМР-линкер в свободном состоянии и иммобилизированных на поверхностях различного рода (стекла, полимерных микросфер, металлов) в зависимости от вязкости/жесткости микроокружения.
  4. Изучить фотофизические свойства новых соединений, проявляющих свойства ФМР в составе супрамолекулярных комплексов с нативными белками, амилоидными фибриллами и ДНК.
  5. Создать макет сенсора для измерения микровязкости и количественного определения нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) и амилоидных фибрилл в биологических образцах.
Актуальность (решаемые проблемы):

Актуальность проекта состоит в создании новых высокочувствительных флуоресцентных сенсоров, позволяющих производить определение микровязкости, концентрации биополимеров и их агрегатов (ДНК, амилоидные фибриллы белков) в жидкостях c высоким пространственным разрешением. В качестве сенсорного элемента планируется использование флуоресцентных молекулярных роторов, характеризующихся сильной зависимостью интенсивности флуоресценции от температуры и вязкостных свойств микроокружения. Таким образом, пространственное разрешение для такого рода флуоресцентных сенсоров будет ограничено разрешением оптического микроскопа и для проведения измерений достаточно образцов малого объема.

Краткое описание создаваемой научно-технической продукции:

1. Синтезированы новые ФМР на основе бензотиазольного и анилинового фрагментов с различной длиной цепи сопряжения между фрагментами, проявляющие внутримолекулярный перенос заряда при фотовозбуждении и обладающие чувствительностью квантового выхода флуоресценции к вязкости микроокружения. Обнаружено, что только катионные формы производных тиофлавина Т проявляют свойства ФМР. Установлено, что в области температур 290К-330К зависимость квантового выхода флуоресценции F катионных производных тиофлавина T в маловязких растворителях хорошо описывается определенной линейной функцией, причем различие в коэффициентах линейной функции для разных растворителей свидетельствует о том, что скорость кинетики дезактивации возбужденного состояния катионных форм производных тиофлавина Т определяется не только вязкостью, но и иными свойствами растворителя (полярностью, специфическими взаимодействиями).

2. Синтезирован ФМР-линкер Th-C7 с внедренной карбоксильной группой. Произведена иммобилизация молекул Th-C7 на поверхности стекла, покрытого (3-аминопропил)триэтоксисиланом (APTES). Показано, что при увеличении жесткости микроокружения молекул Th-C7 на APTES-слайде посредством нанесения пленки поливинилового спирта интенсивность флуоресценции Th-C7 значительно возрастает, т.е. молекула Th-C7 в иммобилизованном состоянии сохраняет чувствительность к изменению вязкости/жесткости микроокружения. Однако, нам не удалось химически привязать ФМР-линкер Th-C7 к APTES посредством ковалентной связи, и было обнаружено, что иммобилизация на поверхности стекла достигается вследствие электростатического взаимодействия, что ограничивает область использования данного сенсора.

3. Методами мягкой литографии изготовлены проточные камеры для микроскопии для проведения флуоресцентных измерений с малыми объемами образцов. Обнаружено, что предел детектирования амилоидных фибрилл из инсулина с помощью ФМР на основе производных тиофлавина Т с метилированным атомом азота бензотиазола составляет ~ 50 пг/мкл.

Область применения результатов НИОКР:

Полученные результаты могут применяться в флуоресцентной микроскопии, микрофлюидике, биотехнологиях и медицине.

Технические преимущества по отношению к лучшим отечественным и зарубежным аналогам:

Новые красители характеризуются поглощением и флуоресценцией м красной области спектра и проявляют сильную зависимость интенсивности флуоресценции от вязкости и жесткости среды. Они обладают высокой специфичность к амилоидным фибриллам. Модифицированные производные, содержащие активные группировки, позволяют сорбировать молекулы на поверхности стекла или металла. Это открывает возможность на их основе создавать флуоресцентные сенсоры. Зарубежные аналоги ФМР, специфичных по отношению к амилоидным фибриллам и имеющие поглощение в красной области, в литературе не описаны.

Экономические преимущества:

Использование флуоресцентных маркеров, имеющих флуоресценцию в области окна прозрачности биологических тканей, позволяют производить детекцию амилоидных фибрилл в условиях in vivo и in situ. Методики количественного и качественного анализа с использованием флуоресценции характеризуются высокой точностью и малыми затратами времени.

Потенциальные потребители создаваемой научно-технической продукции:

Учреждения здравоохранения, научно-исследовательские институты, использующие спектрально-люминесцентные методы исследований биополимеров в нативном и агрегированном состоянии.

Контактная информация:

Учреждение образования «Гродненский государственный университет имени Янки Купалы» (Степуро В.И., Маскевич А.А., Лавыш А.В.)
Белорусский государственный университет (Воропай Е.С., Луговский А.А.).
Степуро Виталий Иванович
Тел.: +375 152 61 01 46
e-mail: stsiapura@gmail.com